常温运输的【悬浮生长细胞】制备操作说明常温运输的【悬浮生长细胞】制备操作说明 本操作适用于悬浮生长的细胞 第一、悬浮生长细胞共同特性: 生长方式: 悬浮生长 培养方式:垂直放置CO2培养箱(5%CO2+37°+95%湿度),通气培养(无菌) 运输条件:常温运输 X细胞(例如K562、NK-92、THP-1等)悬浮生长,不能直接换液。可通过补液后垂直培养实现营养补充。若需要换液,先2000转离心5分钟,弃掉上清再用完全培养基重悬。但这样换液相当于传代一次,对细胞生长增殖有影响。 X细胞(例如K562、NK-92、THP-1等)12h或24h左右倍增一代。生长代谢正常的细胞培养基隔夜就会变黄,需要每天补液(不需要换液)一次。每次补液量,为上次总体积的1.5倍。 补液总体积不宜超过70ml,以确保细胞良好状态和“安全”生长。 常规培养条件:90% RPMI-1640+10%FBS+1X双抗+5%CO2+37°+O2+95%湿度 B、FBS(胎牛血清):CytoBiotech(驷拓柏腾),Cat#FBS-F-500; C、双抗:CytoBiotech(驷拓柏腾),Cat#PS-100X,使用浓度1X 第二、15ml离心管常温运输的【悬浮生长细胞】制备操作说明: 1、实验准备:预热完全培养基6ml,预先标记透气T25瓶2个,无菌的剪刀,1ml枪头及移液器等耗材。 2、消毒:超净台或生物安全柜内,将运输悬浮细胞单悬液的离心管表明酒精棉球擦拭消毒,去掉封口膜,再次酒精棉球擦拭消毒。 3、分瓶与接种: a、预先将T25透气瓶A,添加5ml的完全培养基 (1640或H-DMEM),盖上盖。 b、1ml移液器插上1ml无菌枪头。取无菌的剪刀,剪掉1ml枪头尖约2cm。 c、使用去掉枪头尖的移液器,吸取7.5ml(约离心管总体积的1/2)单悬液(此步骤,也可将15ml离心管口过火后,直接导入培养瓶,但需要确保无菌操作),沿着瓶壁接种到T25透气瓶A内。不吹打,也不晃动,垂直放置CO2培养箱透气培养48h。 d、剩余的单悬液,按照c方法接种到透气T25透气瓶B中,水平放置CO2培养箱透气培养24h后补完全培养基5ml。 4、观察或补液: a、垂直培养的T25透气瓶A,水平放置显微镜先观察细胞是否成串或团状,培养基是否变黄,并4X、10X和20X拍照。拍照完,立即垂直放置培养箱继续培养24h后补完全培养基5ml。 b、水平培养的T25透气瓶AB,水平放置显微镜先观察细胞是否成串或团状,培养基是否变黄,并4X、10X和20X拍照。拍照完,超净台或生物安全柜内补液预热过的完全培养基5ml,水平放置培养箱继续培养24h。止到T25瓶总体积大于10ml以后,将T25透气瓶AB垂直放置培养。 5、换液或离心条件:20-25°(室温)2000转,5min, 6、注意事项:悬浮细胞 ,切忌直接换液(细胞会大量丢失),切忌频繁离心换液。采取补液方式,更有利于高密度细胞的扩增和高活力细胞的富集。 7、若有问题,请对新更换培养瓶外观拍照和细胞形态显微拍照备案,并邮件CytoBio@qq.com。 第三、细胞冻存条件: RPMI-1640(或H-DMEM):FBS:DMSO(Sigma#D2650-100ML)=7:2:1,或者:10% DMSO(Sigma#D2650-100ML)+90% FBS(优质胎牛血清,不需要添加培养基或者其他组份)。冻存细胞请遵守“慢冻存、快复苏”的原则。 更多,联系我们了解。 |