常温运输的【悬浮生长细胞】制备操作说明常温运输的【悬浮生长细胞】制备操作说明 本操作适用于悬浮生长的细胞 第一、悬浮生长细胞共同特性： 生长方式： 悬浮生长 培养方式：垂直放置CO2培养箱（5%CO2+37°+95%湿度），通气培养（无菌） 运输条件：常温运输 X细胞(例如K562、NK-92、THP-1等）悬浮生长，不能直接换液。可通过补液后垂直培养实现营养补充。若需要换液，先2000转离心5分钟，弃掉上清再用完全培养基重悬。但这样换液相当于传代一次，对细胞生长增殖有影响。 X细胞(例如K562、NK-92、THP-1等）12h或24h左右倍增一代。生长代谢正常的细胞培养基隔夜就会变黄，需要每天补液（不需要换液）一次。每次补液量，为上次总体积的1.5倍。 补液总体积不宜超过70ml，以确保细胞良好状态和“安全”生长。 常规培养条件：90% RPMI-1640+10%FBS+1X双抗+5%CO2+37°+O2+95%湿度 B、FBS（胎牛血清）：CytoBiotech（驷拓柏腾），Cat#FBS-F-500； C、双抗：CytoBiotech（驷拓柏腾），Cat#PS-100X，使用浓度1X 第二、15ml离心管常温运输的【悬浮生长细胞】制备操作说明: 1、实验准备：预热完全培养基6ml，预先标记透气T25瓶2个，无菌的剪刀，1ml枪头及移液器等耗材。 2、消毒：超净台或生物安全柜内，将运输悬浮细胞单悬液的离心管表明酒精棉球擦拭消毒，去掉封口膜，再次酒精棉球擦拭消毒。 3、分瓶与接种： a、预先将T25透气瓶A，添加5ml的完全培养基 （1640或H-DMEM），盖上盖。 b、1ml移液器插上1ml无菌枪头。取无菌的剪刀，剪掉1ml枪头尖约2cm。 c、使用去掉枪头尖的移液器，吸取7.5ml（约离心管总体积的1/2）单悬液（此步骤，也可将15ml离心管口过火后，直接导入培养瓶，但需要确保无菌操作），沿着瓶壁接种到T25透气瓶A内。不吹打，也不晃动，垂直放置CO2培养箱透气培养48h。 d、剩余的单悬液，按照c方法接种到透气T25透气瓶B中，水平放置CO2培养箱透气培养24h后补完全培养基5ml。 4、观察或补液： a、垂直培养的T25透气瓶A，水平放置显微镜先观察细胞是否成串或团状，培养基是否变黄，并4X、10X和20X拍照。拍照完，立即垂直放置培养箱继续培养24h后补完全培养基5ml。 b、水平培养的T25透气瓶AB，水平放置显微镜先观察细胞是否成串或团状，培养基是否变黄，并4X、10X和20X拍照。拍照完，超净台或生物安全柜内补液预热过的完全培养基5ml，水平放置培养箱继续培养24h。止到T25瓶总体积大于10ml以后，将T25透气瓶AB垂直放置培养。 5、换液或离心条件：20-25°（室温）2000转，5min， 6、注意事项：悬浮细胞 ，切忌直接换液（细胞会大量丢失），切忌频繁离心换液。采取补液方式，更有利于高密度细胞的扩增和高活力细胞的富集。 7、若有问题，请对新更换培养瓶外观拍照和细胞形态显微拍照备案，并邮件CytoBio@qq.com。 第三、细胞冻存条件： RPMI-1640（或H-DMEM）：FBS：DMSO（Sigma#D2650-100ML）=7:2:1，或者：10% DMSO（Sigma#D2650-100ML）+90% FBS（优质胎牛血清，不需要添加培养基或者其他组份）。冻存细胞请遵守“慢冻存、快复苏”的原则。 更多，联系我们了解。 |