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【悬浮细胞】表面分子免疫荧光染色和共聚焦样本制备操作步骤

作者:Cell Gao

【悬浮细胞】表面分子免疫荧光染色和共聚焦样本制备操作步骤:

图片1:CD4+T细胞CD4/CD25/FoxP3流式检测直方图;

图片2:CD4+T细胞TLR9染色照片(DAPI染核,荧光二抗绿色)

图片3:小枪头套在大枪头演示照片;

图片4:含DAPI抗荧光淬灭的封片剂实物照片。

1、【细胞准备】体外培养或原代分离或分选悬浮生长的目的细胞(以PBMC为了的CD4+T细胞表面TLR9分子染色为例),达到给药时间点,准备进行免疫荧光染色实验(单标或双标)。

2、【细胞准备】收集悬浮细胞到无菌的1.5ml EP管(约1000ul,细胞数目大于1*10e6),1200转离心5分钟。

3、【细胞清洗】无菌环境下,调整1ml移液器量程到980ul,适配1ml无菌加长枪头。再在1ml无菌加长枪头上(外)套上10ul无菌枪头(小枪头套在大枪头外,见图3),依次缓慢吸弃1.5ml EP管内的细胞上清到废液缸,残留约20ul。

4、【细胞固定】吸取4% 多聚甲醛(常温,无需预冷)500ul ,沿着管壁加入1.5ml EP管,盖上盖,用中指轻轻弹1.5 ml EP管底部5次以上,使细胞沉淀重悬(别用移液器吹打,会让总细胞数目丢弃10%以上。)。常温放置15分钟,便可完成细胞的固定。

5、【细胞清洗】1200转离心5分钟,无菌环境弃掉上清。

6、【细胞清洗】吸取1ml 4度预冷的无Ca2+和Mg2+的1X PBS,沿着管壁加入1.5ml EP管,盖上盖。用中指轻轻弹1.5 ml EP管底部5次以上,使细胞沉淀重悬。

7、【细胞清洗】1200转离心5分钟,无菌环境弃掉上清。重复操作步骤5和6,清洗2遍(不包括弃掉细胞上清的一遍)。

8、【细胞破膜和封闭】准备免疫染色封闭液(QuickBlock免疫染色封闭液,碧云天,Cat#P0260),预先常温恢复20分钟+。吸取500ul,沿着管壁加入1.5ml EP管,盖上盖,用中指轻轻弹1.5 ml EP管底部5次以上,使细胞沉淀重悬。常温放置5分钟,便可完成细胞的固定。

9、【细胞清洗】1200转离心5分钟,无菌环境弃掉上清。重复操作步骤5和6,清洗2遍(不包括弃掉细胞上清的一遍)。

10、【免疫荧光染色准备】预先常温平衡一抗(间接标记)20分钟+后,将抗体管1500转离心30秒。

11、【免疫荧光染色一抗稀释】使用常温平衡20分钟+的一抗稀释液(SignalUp免疫染色检测增敏剂,碧云天,Cat#P0276),按照250:1稀释一抗(498ul的一抗稀释液+2ul 一抗原液),混匀。

12、【免疫荧光一抗孵育】吸取操作步骤11中的一抗工作液,加入操作步骤9中的1.5ml EP管。用中指轻轻弹1.5 ml EP管底部5次以上,使细胞沉淀重悬(也可用200ul移液器重悬)。4度孵育过夜,便可完成细胞一抗抗原抗体的结合。

13、【细胞清洗】1200转离心5分钟,无菌环境弃掉上清。重复操作步骤5和6,清洗2遍(不包括弃掉细胞上清的一遍)。

14、【免疫荧光二抗稀释】使用常温平衡20分钟+的一抗稀释液(SignalUp免疫染色检测增敏剂,碧云天,Cat#P0276,可用于一抗和二抗的稀释),按照1000:1稀释一抗(999ul的一抗稀释液+1ul 二抗原液),混匀(注意:二抗为抗一抗种属来源的)。

15、【免疫荧光二抗孵育】吸取操作步骤14中的二抗工作液500ul,加入操作步骤13中的1.5ml EP管。用中指轻轻弹1.5 ml EP管底部5次以上,使细胞沉淀重悬(也可用200ul移液器重悬)。4度避光孵育1小时,便可完成细胞荧光二抗染色。

16、【细胞清洗】1200转离心5分钟,无菌环境弃掉上清。重复操作步骤5和6,清洗2遍(不包括弃掉细胞上清的一遍)。

17、吸取200ul 含DAPI抗荧光淬灭的封片剂 (碧云天,Cat#P0131-25ml),加入操作步骤16中的1.5ml EP管。用中指轻轻弹1.5 ml EP管底部5次以上,使细胞沉淀重悬(也可用200ul移液器重悬)。

18、吸取150ul操作步骤17中染过色的细胞,滴加到载玻片上,再用直径为20mm的圆形盖玻片缓慢压在液滴上方,以便“固定”细胞,方便成像。或者,滴加到直径为20mm的35mm共聚焦底部玻片上,盖上盖,直接共聚焦成像(也可加直径为15mm的圆形盖玻片,以便“固定”细胞。)。

19、避光共聚焦,先低倍再高倍镜头,40X成像。

备注:

a、添加封片剂染色后的细胞,4度避光可保持一周以上不淬灭或褪色。不过,越早成像越好。

b、免疫荧光染色,也可用直接标记的荧光一抗染色,但尽量使用间接法(一抗+荧光二抗染色),特异更好。CD4-CD25-Foxp3流式截图.jpgeb4dc37cc7f15956bbb0186d8944237.jpgTRL9.png40a6461e7ff36d347ae0a153d75bd15.jpg


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