“润湿消化法”消化传代细胞操作步骤

“润湿消化法”消化传代细胞操作步骤如下：

a、吸弃或倒掉培养瓶内所有培养基。

b、预热的PBS清洗两遍，分别4ml和3ml。

c、吸取500ul含EDTA的胰酶滴加入T25瓶内，轻轻水平晃动。

d、待胰酶均匀润湿细胞表面后，计时10秒。吸出所有的胰酶，盖上盖。

e、将T25瓶水平放置37度培养箱，孵育消化细胞2分钟。

f、无菌环境，向T25瓶内添加3ml完培（或专培，依据细胞培养条件而定。本操作视频以Huvec消化为例，使用的是ECM条件培养基终止消化。），轻轻吹打，混匀，便实现终止消化。

g、取1.5ml单悬液1000转离心5分钟，弃掉上清使用700ul冻存重悬后冻存

h、剩余的1.5ml单悬液，不用离心直接接种2个T25瓶，分别补液到6ml/T25 ECM专培（或者完培，依据细胞培养条件而定）。

i、传代培养24h或48h后，换液6ml/T25瓶预热的完培或专培（依据细胞贴壁的时间来定，例如：A2780/DDP、MCF-7、HepG2及HepG2215细胞接种后48h才能完全贴壁，48h换液）。

备注：使用“润湿消化法”消化传代细胞，T25瓶内残留的低于50ul的胰酶，不会影响细胞的生长增殖，已经反复验证。