悬浮细胞慢病毒VS腺病毒感染技巧和经验分享

图123：人急性髓细胞性白血病细胞(OCI-AML-3 )；

题记：悬浮生长的细胞，用慢病毒感染构建稳定株，还是腺病毒感染瞬时表达呢？无论慢病毒，还是腺病毒感染悬浮细胞，若带有荧光报告基因（GFP、RFP等）可直观判断感染效率。

故，本笔记以慢病毒（1*10e8 U/ml）和腺病毒（1*10e10 U/ml）分别感染悬浮生长的U-937细胞、MOLM13细胞、AML-3细胞。测试基础、技巧和经验如下：

1、三株细胞培养条件均为：细胞培养条件：89% 1640+10%FBS+1X双抗+5%CO2+37+O2+95%湿度。好养！

2、3株细胞均属于悬浮生长的细胞，反复验证可通过“补液后垂直放置培养”方式实现“换液”和细胞大量扩增。

3、3株细胞转染、感染效率和方式比较：

a、3株细胞用于瞬转时，转染效率均低。

b、慢病毒（1*10e8 U/ml）感染72h-96h，未见荧光表达。可见，这3株细胞通过慢病毒感染很难构建稳定细胞株。

c、腺病毒感染3株细胞，48h开始荧光表达。同样滴度的腺病毒（1*10e10 U/ml）感染3株细胞，感染效率不同。腺病毒感染效率为：人急性髓性白血病细胞（MOLM13）>人急性髓细胞性白血病细胞(OCI-AML-3 )》人组织细胞淋巴瘤细胞 (U-937) 。可见人组织细胞淋巴瘤细胞 (U-937) 更难感染。

第一、悬浮生长的细胞能否用慢病毒感染，并构建稳定株呢？

答案是肯定的。例如，我们利用慢病毒（1*10e8 U/ml）成功构建过人白血病T淋巴细胞(J.RT3-T3.5-Jurkat)的TCR过表达稳定株。

第二、如何选择用慢病毒还是腺病毒感染悬浮细胞呢？

建议在确定构建稳定株方案前，用慢病毒空载（pCD -GFP-O）和腺病毒空载（例如：Ad-GFP-U6）或细胞自噬双荧光报告基因腺病毒（mCherry-LC3-GFP）感染目的细胞，分别以不同滴度方式感染悬浮生长的目的细胞。感染和观察96h以上，活细胞成像或荧光显微镜成像或流式判断是否被感染上，及其感染效率。再根据感染效率、感染后细胞状态和增殖情况，确定后续实验构建慢病毒或腺病毒或感染。

第三、还有那些悬浮细胞慢病毒很难成功构建稳定株，必须腺病毒感染呢。

我们反复测试和验证，还有人或小鼠中心粒细胞、人或猪树突状DC细胞、 人T淋巴细胞白血病细胞(HuT 78）等。慢病毒感染不上或细胞状态不佳，必须腺病毒感染才能实现较高的感染效率或感染后目的基因的表达。