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细胞侵袭迁移TransWell实验步骤和技巧

作者:Cell Gao
图1:侵袭到下室细胞成像72h照片;
图2:侵袭到下室细胞成像48h;
图3:侵袭到下室细胞成像24h照片;
图4:侵袭到下室细胞成像0h照片

细胞侵袭迁移TransWell实验操作步骤、方法、技巧和经验:
a、【材料准备】预先4度预冷1ml加长枪头、H-DMEM基础培养基和5ml离心管,消毒剪刀。
b、【Matrigel基质胶解冻】从负20度冰箱取出预先冰上分装的50ul/管的Matrigel(基质胶,Corning#356234)),4度解冻。
c、【Matrigel基质胶取材准备】超净台,用无菌剪刀剪掉1ml加长枪头的吸头处1.5cm(约占整个枪头的1/6),使吸头孔变粗平整。
d、【Matrigel基质胶包被稀释】超净台内冰上,按照1:80的稀释比例,用剪平的枪头吸取2972.5ul   H-DMEM基础培养基和37.5ulMatrigel基质胶,加入预冷的5ml离心管内,混匀。
e、【Matrigel基质胶包被】预先将小室从原24孔TransWell细胞培养板的BC行,分别移到A行和D行。再按照100ul/Well的剂量,用剪平的预冷枪头吸取稀释过的基质胶,垂直添加到TransWell细胞培养板小室底部。轻轻晃动,自然铺平。避免气泡或月牙状产生。
f、【Matrigel基质胶固化】将包被了基质胶的TransWell细胞培养板放入37度CO2培养箱,固化30分钟。
g、【Matrigel基质胶废液去除】用100ul量程的移液器,调整到95ul刻度,缓慢(不接触底部)吸出小室内的培养基。
h、【细胞计数和接种】按照细胞计数的基数,用H-DMEM基础培养基配置细胞单悬液(20K/Well,100ul),并接种到包被和固化过基质胶的小室内(上室) 。
i、【下室补完培】将TransWell细胞培养板B行和C行,每孔分别添加750ul H-DMEM完全培养基(含FBS 10%)。
j、【上室复位共培养】再将接种有细胞的小室(20K/Well,100ul),分别从A行和D行,放入B行和C行的孔内,一一对应。
k、【侵袭到下室细胞成像准备】再将小室,分别从B行和C行的孔内移到A行和D行孔内,一一对应。
l、【侵袭到下室细胞成像】将24孔TransWell细胞培养板,放入实时动活细胞成像系统内,设置明场成像。其数据为0h的基础数据。
m、【上室复位共培养】成像结束,超净台内将24孔TransWell细胞培养板小室分别从A行和D行,放入B行和C行的孔内,一一对应。
n、【上室复位共培养24h】再将24孔TransWell细胞培养板水平放置CO2培养箱,37C°培养24h。
o、【上室复位共培养24h、48h、72h并成像】每24h,取出TransWell细胞培养板,移开上室(操作同k-m)放入实时动活细胞成像系统内成像一次。共培养72h或96h,检测4或5个时间点。
p、【数据分析与比较】数据分析,导出时间间隔侵袭下室的照片中细胞数目或细胞汇合度,并差异分析。

注:
1、借助实时动活细胞成像系统的细胞侵袭迁移TransWell实验,不需要去掉上室基顶膜结晶紫染色。并每个下室孔可实现0h、24h、48h、72h和96h细胞侵袭迁移细胞照片和数据的采集,不需要接种多个小室以时间点来采集数据。
2、细胞迁移TransWell实验,与细胞侵袭TransWell实验操作方法相同,唯一区别。细胞迁移TransWell实验时,上室不用包被Matrigel基质胶。



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