细胞冻存操作过程视频和步骤

1、【准备工作】：

a、显微镜下观察细胞，细胞融合度达到80%以上（抱团生长细胞，融合度60%以上），进行冻存（或传代）。

b、用75%酒精和无尘布，将超净工作台（生物安全柜）台面，按照左右顺序充分擦拭。摆放好离心管、1mL移液器、废液缸（干湿分类）。同时，37度预热完全培养基、PBS等培养试剂材料（胰酶不需要预热，但使用前需要从4度冰箱拿出室内平衡）。

c、开启超净台风机（二挡）。将所用试剂材料表面喷洒75%酒精消毒后放入超净工作台内，用酒精棉球擦拭试剂瓶瓶口，去掉封口膜，更换酒精棉球再次擦拭试剂瓶或离心管瓶口。

2、【清洗】（共清洗两次）：在超净工作台内，轻轻晃动瓶内培养液，打开瓶盖，倾斜瓶口将液体倒入废液缸。按4mL/T25瓶的量，用1mL移液器向培养瓶内侧壁加入4ml PBS（预热过的），水平轻轻晃动瓶内液体，倾斜瓶口将液体倒入废液缸。再吸取3ml PBS ，同样方法清洗一遍。最后将瓶中PBS吸取干净，瓶内无PBS残留（弃液时，瓶口不能插入或接近废液缸，应保持3-5cm距离）。

3、【细胞消化】：参考“润湿消化法”消化传代细胞操作步骤或下面视频。

4、【终止消化】：参考“润湿消化法”消化传代细胞操作步骤或下面视频。

5、【细胞计数】：

a、取25ul和50ul均一的单悬液，分别加入975ul和950ul的完全培养基中混匀，进行40倍和20倍稀释。

b、分别取100ul的吸收后的单悬液，接种于96孔板内，各2孔（复孔）。

c、将96孔板放置超净工作台（生物安全柜）内，水平静止3-5分钟，确保细胞均匀沉淀板子底部。

d、将96孔板，放入实时动活细胞成像系统内（或显微镜下计数），成像细胞计数，并建立细胞数据库信息。

6、制备冻存细胞单悬液：离心后，用75%酒精喷洒离心管表面放入超净工作台。离心管开盖，弃掉上清。a、按10e 6细胞/管，加入1ml预先配置的冻存液。

b、再用1mL移液器轻柔吹打（避免产生气泡）含有冻存液细胞悬液8～10次，至细胞形成均一的单悬液。

c、存管盖整齐摆放于超净台内，管盖螺旋口向上，按照10e 6细胞/管/1ml的量，分装预先标记的冻存管内。

细胞冻存液配方（任选其一）：

aa、基础培养：FBS（CytoBiotech/驷拓柏腾,Cat# FBS-F-500）：DMSO（Sigma#D2650-100ML）=7:2:1，或者

bb：90% FBS（（CytoBiotech/驷拓柏腾,Cat# FBS-F-500）,不需要添加培养基或者其他组份）+10% DMSO（Sigma#D2650-100ML）。

7、细胞冻存（冻存细胞请遵守“慢冻存、快复苏”的原则）：

a、将冻存管放入室温放置的程序降温盒中，并直接将盛冻存管的程序降温盒放置-80℃超低温冰箱中。

b、24h后可从程序降温盒中移出，一个月内转入液氮中长期保存（10年+）注意：若暂时不能将添加有冻存液的细胞，放入程序降温盒或降温仪器内梯度降温冻存，可将冻存管放入4度冰箱保存（不超过1小时），以免冻存液在常温下对细胞产生毒害（添加冻存液的细胞不能长期放置室温）。

8、实验结束工作：

将超净工作台（生物安全柜）台面清理干净、照紫外30分钟以上；物污分类、干湿垃圾分类消毒处理。

备注：本细胞冻存操作步骤适合贴壁生长的细胞。