如何高效快速建立Raw264.7-LPS炎症模型？

B、FBS（胎牛血清）：CytoBiotech(驷拓柏腾)，Cat#FBF-F；

C、双抗：CytoBiotech(驷拓柏腾)，Cat#PS-100X，培养体系工作浓度1X
D、细胞支原体污染预防实验材料：CytoBiotech(驷拓柏腾)，Cat#O-V3-B5-1ml。

2、小鼠腹腔巨噬细胞（Raw264.7）生长习性：
A、Raw264.7细胞12h增殖一代（图1）。需勤换液或换液时倍增到1.5倍上次换液的体积。
B、Raw264.7细胞更喜欢更多与CO2接触。在培养皿中培养，比培养瓶培养细胞增殖状态更好，分化更少，消化操作更容易。
C、Raw264.7细胞具有免疫细胞的特性，高表达CD14，慢病毒感染构建稳定细胞株难度很大（图2）。

D、使用“润湿消化法”消化传代Raw264.7细胞，比机械法、传统胰酶浸泡消化法更柔和，可极大程度减少细胞分化现象。
“润湿消化法”消化传代细胞操作步骤如下：

a、吸弃或倒掉培养瓶内所有培养基。

b、预热的PBS清洗两遍，分别4ml和3ml。

c、吸取500ul含EDTA的胰酶滴加入T25瓶内，轻轻水平晃动。

d、待胰酶均匀润湿细胞表面后，计时10秒。吸出所有的胰酶，盖上盖。

e、将T25瓶水平放置37度培养箱，孵育消化细胞2分钟。

f、无菌环境，向T25瓶内添加3ml完培（或专培，依据细胞培养条件而定。本操作视频以Huvec消化为例，使用的是ECM条件培养基终止消化。），轻轻吹打，混匀，便实现终止消化。

g、取1.5ml单悬液1000转离心5分钟，弃掉上清使用700ul冻存重悬后冻存

h、剩余的1.5ml单悬液，不用离心直接接种2个T25瓶，分别补液到6ml/T25 ECM专培（或者完培，依据细胞培养条件而定）。

i、传代培养24h或48h后，换液6ml/T25瓶预热的完培或专培（依据细胞贴壁的时间来定，例如：A2780/DDP、MCF-7、HepG2及HepG2215细胞接种后48h才能完全贴壁，48h换液）。

备注：使用“润湿消化法”消化传代细胞，T25瓶内残留的低于50ul的胰酶，不会影响细胞的生长增殖，已经反复验证。

3、小鼠腹腔巨噬细胞（Raw264.7）细胞特征编码：
STR-11620-11121-Raw264.7-H-DMEM-TryEDTA=4min-TransMed=24h-G2=12h（图3）

第二、小鼠腹腔巨噬细胞（Raw264.7）-LPS炎症模型建立必须做的实验内容：

A、Raw264.7细胞-LPS炎症模型建立---LPS最佳浓度筛选（图456）；

B、Raw264.7细胞-LPS炎症模型建立-LPS浓度与NO表达筛选（图7）。

Raw264.7细胞-LPS炎症模型建立具体实验方法和操作步骤如下：
1、Raw264.7细胞汇合度达到75%左右，状态良好，培养基未变黄，准备消化细胞。

2、预热的PBS分别4ml、3ml清洗2遍。

3、取700ul含EDTA 胰酶添加到T25瓶内，均匀润10秒钟，后吸走所有胰酶。（不要相信机械吹打，不使用胰酶。前者更容易分化）。

4、放到37度培养箱消化4分钟，显微镜下观察，细胞明显有脱落（原本为球形，所以不能以是否变圆作为成功消化的判断标准）。

5、超净台内，取3ml H-DMEM完培终止加入T25瓶，终止消化，并吹打单悬液。

6、取单悬液（母液）倍比稀释（至少100倍）接种96孔板活细胞成像或其他方法细胞计数。

7、按照Raw264.7(5k/Well)细胞数目和实验方案孔数计算工作液。

8、按照Raw264.7(5k/Well/100ul)接种细胞于96孔板，水平放置37度CO2培养箱培养。

9、细胞贴壁过夜后，按照100ul/Well换液37C°预热的H-DMEM基础培养基，同步化4h。

10、同步化（细胞无血清体系适应，并稀释残留的血清）结束后，使用预热的H-DMEM基础培养基配置浓度梯度的LPS工作液，浓度从1ug/ml倍比梯度递减，至少5个浓度。

11、换液给药（LPS），100ul/Well。并成像检测，作为给药0h的基准数据。

12、LPS刺激12h时，取板子成像检测或使用NO试剂盒检测。

13、LPS刺激24h时，取板子成像检测或使用NO试剂盒检测。

14、LPS刺激48h时，取板子成像检测或使用NO试剂盒检测。

15、数据分析与统计，便可筛选出炎症模型建立的条件（可参考笔记中的生长曲线和细胞照片）。