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【细胞凋亡检测】方法介绍---基于实时动态活细胞成像(InCuCyte)平台

作者:Cell Gao

细胞凋亡检测】方法和原理介绍

细胞计数铺板、种瓶或皿贴壁过夜后,按照实验方案给药时预添加细胞凋亡APO-488探针(CellEvent® Caspase-3/7 Green ReadyProbes,绿色荧光)给药后,放置镶嵌有 IncuCyte ZOOM(实时动态活细胞成像观察平台)的CO2培养箱内培养与非浸入细胞培养体系免洗脱式动态监测。设置 IncuCyte ZOOM明场相差、绿色荧光和红色荧光显微自动拍照参数,按照2h/次、3-4个视野//次动态拍照(24孔可设置16个视野/次,其他孔板参考仪器参数)。IncuCyte ZOOM系统自动时间间隔拍照,明场白光下捕捉每个视野或每个孔内细胞形态、面积的变化和细胞汇合度(Phase Object Confluence (Percent))变化;绿色荧光监测凋亡细胞的数目(Green Object Count 1/Well))、荧光强度、面积大小;红色荧光监测活细胞细胞核的数目(Red Object Count 1/Well)),并通过 IncuCyte ZOOM自动软件和数据库分析,形成明场(白光)、绿色荧光(凋亡细胞计数)和红色荧光(活细胞计数)通道连续时间间隔内细胞照片、视频、数值和曲线。

活细胞实时动态计数原理通过makte2-慢病毒体系感染的细胞,在活细胞状态下(包括细胞单悬液状态)细胞核持续稳定发出明亮的红色荧光。荧光显微镜成像后,红色细胞核与周围的其他细胞可区别,并被 IncuCyte ZOOM(实时动态活细胞成像观察平台)软件自动识别、计数和分析。

1、“润湿消化法”消化细胞,不用离心去除胰酶,稀释后直接使用。

“润湿消化法”消化细胞详细操作步骤,请本公众号搜索【“润湿消化法”消化传代细胞操作步骤“润湿消化法”操作过程视频】获得。此处,略。

2、细胞计数。
细胞计数详细操作步骤,请本公众号搜索【如何实现细胞精准计数获得。

3、细胞铺板和细胞给药后分别整板成像,作为给药前后0h的细胞凋亡的基数。

A、细胞铺板后0h细胞凋亡检测:细胞铺板后,细胞培养板超净台内水平放置3分钟,再将96孔板水平放入实时动态活细胞成像活细胞(InCucyte)系统,设置明场和绿色荧光)20X10X成像,每孔成像4个视野。数据分析后,作为细胞接种0h的细胞凋亡基数。

96孔细胞培养板铺板详细操作过程视频,请本公众号搜索96孔板铺板操作过程视频】获得。

B、细胞给药后0h细胞凋亡检测:细胞给药前也可整板成像检测一次,以便确认给药过程是否有细胞脱落或其他现象。至少挑选3孔以上,显微镜下观察,确保细胞无污染、形态舒展、状态良好,再给药。
细胞给药后,将96孔细胞培养板,37度培养箱水平放置5-10分钟。再将96孔细胞板放入实时动态活细胞成像活细胞(InCucyte)系统。设置明场和绿色荧光20X10X成像,每孔成像4个视野。数据分析后,作为细胞给药0h的细胞凋亡基数。
细胞给药配置和操作方法,请本公众号搜索【细胞实验药物配置方法】获得

C、细胞给药后连续时间点细胞凋亡检测:
 由于实时动态活细胞成像活细胞(InCucyte)系统镶嵌在CO2培养箱中,温度、湿度、O2CO2浓度均与CO2培养箱一致。所以,细胞给药成像0h操作结束后,可不取出细胞培养板。设置时间轴,可每1h2h6h12h24h自动检测一次,并数据归集于同一个数据库。也可取出细胞培养板,每12h24h放入成像一次。连续监测72h,甚至更长时间。

4、细胞凋亡检测数据分析和导出。
动态监测72h实验结束后,通过InCuCyte系统自带软件分析统计细胞凋亡(细胞死亡和细胞凋亡)的数目、细胞团数目、细胞汇合度、细胞面积,并绘制细胞生长增殖曲线(细胞死亡/毒性/杀伤/凋亡曲线),导出时间间隔照片和细胞凋亡过程视频。

 A、细胞凋亡数据导出:

 B、活细胞动态计数增殖数据导出:

C、细胞生长增殖和凋亡曲线生成


 D、细胞凋亡时间间隔照片:

E、细胞凋亡过程视频:
请见文章开头封页。

F、其他应用拓展介绍:若使用FAM-siRNAGFP-shRNA质粒转染细胞,或带有GFP报告基因的慢病毒和腺病毒感染细胞,绿色荧光监测转染或感染的细胞的数目(Green Object Count 1/Well))。计算方法同细胞凋亡监测
G、细胞凋亡检测部分文献:
http://www.nature.com/nm/journal/v20/n12/full/nm.3736.html

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