人或小鼠中性粒细胞原代分离方法技巧和经验

图1：腺病毒感染小鼠骨髓来源中性粒细胞时间间隔照片；

图2：小鼠骨髓来源中性粒细胞凋亡时间间隔照片；

图3：小鼠骨髓来源中性粒细胞照片；

图4：小鼠骨髓来源中性粒细胞分离试剂盒实物照片；

图5：人中心粒细胞与人CD4+T细胞共培养过程视频截图；

图6：高密度小鼠来源骨髓中性粒细胞照片。

小鼠骨髓中性粒细胞原代分离操作步骤方法技巧与经验：

1、【配置分离液】取一支无菌硅化离心管（也可用50ml无菌离心管），先加入“分离液 1”：8*3ml，后加入 【“80%浓度分离液 1 ”溶液（“分离液 1”：“样本稀释液”=4：1 的混合液）】：8*1.5ml，形成梯度界面（分离液共计36ml）。

2、【分离加样】用3ml无菌巴氏吸管小心吸取12ml细胞悬液样本，缓慢沿着管壁滴加于分离液之液面上。

3、【离心分离】配平离心机，常温，650-800g ，离心 30min。

4、【收集中性粒细胞】离心后，稀释液层下出现两层白色环状细胞层。超净台内，取下层白色环状中性粒细胞层（会有少量红细胞混杂）。

5、【清洗】将上述取出的中性粒细胞层加 5 倍体积的清洗液混匀。配平离心机，常温，400g 离心 10min。

6、 【清洗】离心后弃上清，再向细胞沉淀内添加5 倍体积的清洗液混匀。配平离心机，常温，400g 离心 10min。

7、【红细胞裂解】离心后弃上清，用红细胞沉降液重悬细胞浓度为 2×10e 8 –1×10e9 /ml 的单细胞悬液，400g 离心 10min。（以小鼠为例，一般使用 1ml 红细胞沉降液重悬骨髓细胞）。

8、【清洗】将上述取出的中性粒细胞层加 5 倍体积的清洗液混匀。配平离心机，常温，400g 离心 10min，清洗2遍。

9、【细胞计数】弃掉上清，细胞沉淀使用1640完培培养基重悬后，细胞计数。

10、【细胞活力监测】接种细胞于96孔板或24孔板，分别添加Ki-488（绿色探针）和Apo-480探针，监测细胞活力和凋亡水平。

11、【细胞冻存保种】剩余细胞，按照1*10e7/管，使用1640基础培养配置的冻存液，冻存保种。

总结：胫骨需要在预冷的PBS或分离试剂盒中的样本稀释液中剪裁成4段，分别用5ml注射器重悬，才能获得大量骨髓来源的中性粒细胞。分离时密度不能太高，否则分离不开。另外，此方法适合天津灏洋的小鼠骨髓中性粒细胞分离试剂盒。其他厂家方法相近，具体以试剂盒说明书为准。