慢病毒（腺病毒）纯化凝缩方法技巧与经验

图1：过表达CADM1基因的A549细胞稳定株细胞照片Merge；

图2：过表达CADM1基因的A549细胞稳定株绿色荧光照片；

图3：过表达CADM1基因的A549细胞稳定株明场照片；

备注上述：为了测试纯化慢病毒的感染效率或效果，取使用下面方法纯化过的过表达CADM1基因带GFP报告基因的慢病毒，感染X细胞8h，再收集感染的上清（废弃的慢病毒），放置负20度冰箱冻存7天。去除慢病毒废液直接感染6孔板单孔的A549细胞。24h+15h传传代获得阳性了大于95%的绿色荧光GFP标记的过表达CADM1基因的A549细胞稳定株。

慢病毒（腺病毒）纯化凝缩方法技巧与经验分享：

1、收集48h或72h的慢病毒上清，常温（25度）2000转离心10分钟，以备去除细胞碎片或沉淀。

2、使用3ml无菌的巴氏吸管缓慢吸取离心过的病毒上清（50ml离心管底部留500ul，以免沉淀脱落，导致细胞交叉污染），移液到新的50ml无菌离心管。再按照1ml 的慢病毒上清内，添加250ul的【LV-Gao 病毒浓缩液】。室温震荡重悬3次上清，每次间隔15分钟。间隔期间，将其放置4度冰箱。

3、充分震荡混匀后，4度冰箱过夜。

4、配平离心机，管盖和壁多重标记。常温，4740转(4005g )离心30分钟（4500转会让5ml离心管盖脱落，管底破裂。反复验证过Jet公司50ml离心管可满足病毒纯化的要求）。设置每15min离心一次，共2次。

5、离心结束，50ml离心管表面75酒精消毒后，超净台内直接倒掉上清于废液缸（巴氏吸管或电动移液器吸更容易触碰到病毒沉淀），可见白色沉淀。准备感染目的细胞所用的基础培养基（或Hank2平衡液），200ul/50ml离心管。

6、1ml无菌枪头，套10ul无菌枪头，伸入50ml离心管内底部重悬病毒沉淀。重悬时，先每次吸80ul快速吹打病毒沉淀。待吹散沉淀后，再调整到120ul的量程，缓慢吹打。

7、使用感染目的细胞所用的无双抗完培，配置含助转染试剂（通常2ug/ml，总体积例如6孔板单孔 800ul）。再吸取上述6中的纯化过的病毒。

8、吸取待感染目的细胞的培养上清，按照6孔板单孔1ml的感染体积添加上述7中的病毒。

9、放入37度培养箱正常培养，（感染）6h-8h后换液完培正常培养。

10、纯化过病毒的废液废物，放入高压灭菌锅或者密封空间O3通气消毒充分后，分类丢弃。

11、感染24h后成像或荧光显微镜下观察荧光表达的情况。