灌满液运输和3D运输【贴壁生长细胞】制备操作说明

灌满液运输和3D运输【贴壁生长细胞】制备操作说明

本操作适用于贴壁生长的细胞

第一、灌满液运输【贴壁生长细胞】制备说明：

1、【消毒观察】收到细胞，T25瓶表面75%酒精消毒后，显微镜下4X、10X、20X观察（是否有细胞脱落或碎片，是否有污染、形态是否完整）。

2、【细胞恢复】去掉封口膜，酒精棉球擦拭瓶颈和瓶盖，垂直放置37°CO2培养箱里，再松一圈瓶盖，培养（恢复）30分钟。

3、【观察细胞】再次显微镜下4X、10X、20X观察细胞形态和细胞融合度（汇合度）。

4、【收集培养基】超净台内倒出T25瓶内所有培养基，收集于2*50ml离心管（若细胞碎片或脱落较少，不离心），2000转离心5分钟。取上清，补加5% FBS（可添加1X双抗）后4度保存，后续细胞培养继续使用。

5、【细胞清洗】确保细胞汇合度大于90%以上可传代或冻存（抱团生长细胞汇合度达到50%），例如Hep G2细胞、LNCaP细胞）。向T25瓶内，添加4ml预热的PBS，左右方向轻轻晃动2次清洗细胞，弃掉上清。再次，按此方法清洗细胞1遍（共清洗2遍）。

6、【细胞消化】向T25瓶内缓慢添加1ml 含EDTA的胰酶（0.25%），左右方向轻轻晃动2次，胰酶均匀分布于T25瓶内底部。水平放置CO2培养箱（37°）消化30秒（具体消化时间以胰酶和细胞自身特点而定，可参考细胞识别特征编码‍）。取出T25瓶显微镜下（水平放置）观察细胞形态变化，细胞变圆或形态明显收缩后终止消化。

7、【消化终止】超净台内，向T25瓶内添加3ml完全培养基终止消化。

8、【细胞单悬液制备】使用1ml移液器，缓慢吹打约10-15次，成单细胞悬液。均分移液到2个5ml离心管或2个15ml离心管（1/2冻存，1/2传2*T25瓶），1200转离心5分钟 。

9、【细胞冻存和传代】超净台内，弃掉上清。1/2冻存，1/2传2*T25瓶（5ml体系 /T25瓶）。

10、注意事项：
a、第五步的【细胞清洗】时，若有细胞脱落，收集洗液，1200转离心5分钟，细胞沉淀重悬接种T25瓶内培养。

b、传代后的贴壁细胞水平放置培养基内培养。

第二、3D运输【贴壁生长细胞】制备说明：

A、注意事项：
a、3D运输包装的可立离心管或冻存管或EP管不防爆，不耐低温；管内也不含DMSO，请勿直接放入-80度冰箱或者液氮冻存。请务必按照下面操作指南接种细胞。

b、本操作传瓶数目和体积，主要细胞总数目介于5*10e5到1*10e6细胞数/管之间的，若细胞数目大于10e7/管，可使用10cm的细胞培养皿接种。操作方法相同，培养体系总体积不同。

B、操作说明：

1、【表面消毒】收到细胞后，用75%的酒精喷外包装和冻存管(或离心管或EP管)的外部（消毒），并冻存管(或离心管或EP管)垂直放置超净工作台通风2分钟。酒精棉球擦拭冻存管(或EP管)外周后，拆掉封口膜后，更换酒精棉球再次擦拭管口。

2、【材料准备】准备2个T25培养瓶（透气盖），分别标记为T25瓶A和T25瓶B；预热的10ml-15ml完全培养基（H-DMEM）。

3、【细胞接种】止血钳（或镊子）打开管盖，按照下面操作步骤重悬接种细胞：
细胞接种密度要求：1管传2个T25瓶（贴壁过夜后融合度大于35%，小于50%）。
a、【单悬液制备和接种】用1ml的移液器将冻存管(或EP管)内细胞运输液（约1.8ml+）轻轻吹打10次，目测无明显细胞沉淀或细胞颗粒或细胞团。从冻存管内，吸取1ml单细胞悬液，接种到预先盛有5ml 完全培养基（H-DMEM）的T25瓶A；吸取800ul单细胞悬液，接种到预先盛有5ml 完全培养基（H-DMEM）的T25瓶B中。再从T25瓶B中吸取1ml的单悬液，轻柔吹打清洗冻存管内2遍，并收集每次的洗液至T25瓶B内。
b、【细胞观察】拧紧T25瓶盖（透气盖），丢弃细胞运输冻存管(或EP管），酒精棉球擦拭超净台面。

显微镜下4X、10X、20X观察、拍照和记录。若还有大量细胞团，用1ml移液器缓慢吹打细胞5-10次。

c、【细胞培养】将T25瓶水平放置于含5% CO2、95%湿度的37度CO2培养箱内，正常培养。

d、【细胞观察和换液】细胞接种24h后，显微镜下观察，并换液。即：缓慢移动培养瓶，超净台内倒掉培养瓶内的废液，向T25瓶内缓慢添加预热的5ml完全培养基（请勿PBS清洗或直接吹打细胞！）。

e、【细胞观察】细胞接种48h后，显微镜下观察。细胞融合度低于80%的，换液；细胞融合度大于80%的，传代或冻存。