如何实现细胞精准计数？

1、“润湿消化法”消化细胞，不用离心去除胰酶，稀释后直接使用。

本公众号搜索【“润湿消化法”消化传代细胞操作步骤】，便可获得详细操作步骤和过程视频。此处，略。

2、细胞计数精准识别的操作步骤。

a、轻柔充分地吹打（约10次）消化的细胞悬液（简称母液），成单细胞悬液状态。

b、取10ul单细胞悬液（母液），加入预先添加有990ul的完全培养基的1.5ml EP管内，吹打均匀，制备细胞计数用的单细胞工作液。

c、分别取100ul和200ul的单细胞工作液（100倍稀释），接种于96孔板内，各1孔（也可复孔或3孔或多孔）。

c、将96孔板放置超净工作台（生物安全柜）内，水平静止3-5分钟，确保细胞均匀沉淀（不一定贴壁）板子底部。

d、将96孔板，水平缓慢放入活细胞成像系统内（InCucyte），成像2个时间点。

e、分析、导出与取舍数据，计算1ul母液中细胞的数目。

aa、下图123先后为：A2孔ARPE-19细胞计数后成像系统成像的6/9视野照片，分析后软件识别的照片和细胞计数识别的细胞数目标识（Mask）照片。备注：本视野内有18个细胞。



bb、下图123先后为：A2孔ARPE-19细胞计数后成像系统成像的3/9视野照片，分析后软件识别的照片，细胞计数识别的细胞数目标识（Mask）照片。备注：本视野内有11个细胞。
aa与bb比较可见：活细胞成像系统计数和分析，可精准的识别细胞。

cc、细胞计数数据分析后，导出和曲线生成。

f、按照接种96孔板单孔的接种细胞数目，计算母液和完全培养基的添加体积，并配置单细胞工作液铺板备用。

备注：通常配置铺板用的单细胞工作液为实际用量的1.2倍，备用。