人成纤维细胞（FB）培养经验和技巧

1、人成纤维细胞（FB）培养条件和材料：

培养条件：89% H-DMEM+10%FBS+1X双抗+5%CO₂+37℃+O₂+95%湿度。
A、H-DMEM培养基：Corning，Cat#10-013-CVR，高糖培养基含糖25mM或4.5g/ml，含谷氨酰胺，含丙酮酸钠，含酚红；

B、FBS（胎牛血清）实验材料信息：CytoBiotech(驷拓柏腾)，Cat#FBS-F-500。

C、双抗：CytoBiotech(驷拓柏腾)，Cat#PS-100X，使用浓度1X。

D、细胞支原体污染预防试剂：CytoBiotech(驷拓柏腾)，Cat#O-V3-B5-1ml。

2、培养经验与技巧：
A、人成纤维细胞（FB）非常好养，但需要使用优质胎牛血清，否则有空泡或增殖慢。

B、细胞消化时，减少胰酶浸泡和离心，会增加细胞的活力，传代接种后形态、状态更良好。建议使用“润湿消化法”消化细胞。

C、此细胞使用H-DMEM培养基（含糖25mM或4.5g/L），DMEM（5.5mM）增殖慢。
E、换液或PBS清洗时，一定37度预热。消化时，用预热的PBS清洗两遍，会延缓细胞脱落时间，减少细胞损伤。
F、细胞划痕时，细胞接种密度和划痕时间（接种后多久划痕）非常重要。直接影响细胞划痕是否整齐。

G、人成纤维细胞（FB）汇合度大于95%以上，才表现出明显的纤维状。

3、细胞特征编码：

11289-FB-H-DMEM-TryEDTA=1min-TransMed=72h-DT=24h-AdherentT=6h

4、细胞消化

“润湿消化法”消化细胞，不用离心去除胰酶，稀释后直接使用。

a、吸弃或倒掉培养瓶内所有培养基。

b、4ml预热的PBS清洗两遍。

c、吸取500ul含EDTA的胰酶滴加入T25瓶内，轻轻水平晃动。

d、待胰酶均匀润湿细胞表面后，计时10秒。吸出所有的胰酶，盖上盖。

e、将T25瓶水平放置37度培养箱，孵育消化细胞2分钟。

f、无菌环境，向T25瓶内添加3ml完培（或专培，依据细胞培养条件而定。），轻轻吹打，混匀，便实现终止消化。

g、取1.5ml单悬液1000转离心5分钟，弃掉上清使用700ul冻存重悬后冻存

h、剩余的1.5ml单悬液，不用离心直接接种2个T25瓶，分别补液到6ml/T25 ECM专培（或者完培，依据细胞培养条件而定）。

i、传代培养24h或48h后，换液6ml/T25瓶预热的完培或专培（依据细胞贴壁的时间来定，例如：A2780/DDP、MCF-7、HepG2及HepG2215细胞接种后48h才能完全贴壁，48h换液）。

备注：使用“润湿消化法”消化传代细胞，T25瓶内残留的低于50ul的胰酶，不会影响细胞的生长增殖，已经反复验证。

5、细胞冻存操作：

将细胞单悬液，1200转离心5分钟，去掉上清。细胞沉淀使用700ul的冻存液重悬。细胞冻存一定遵守“慢冻存、快复苏”的原则冻存细胞。细胞冻存液配置比例如下。
A、H-DMEM：FBS：DMSO（Sigma#D2650-100ML）=7:2:1，
B、90% FBS（优质胎牛血清，不需要添加培养基或者其他组份）+10% DMSO（Sigma#D2650-100ML）。

6、细胞复苏操作：
从负80度冰箱或干冰（液氮中取出的细胞需要负80度恢复后再复苏，增加成活率）中取出细胞（注意干冰或液氮使用安全），迅速放入37℃温水中融解（轻柔摇晃，1-2min）。待冻存管中冰粒残留有“米粒”大小时，先酒精喷洒并擦拭，再将冻存管内的细胞放置离心机，配平。1000转，离心5分钟去除冻存液。
具体操作详细操作步骤，请本公众号搜索【细胞复苏操作过程视频】获得。
7、细胞生长增殖曲线：

8、细胞生长时间间隔照片：

9、细胞划痕伤口愈合过程时间间隔照片：

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