人自然杀伤细胞（NK-92）制备说明书

细胞名称：人自然杀伤细胞（NK-92）

货号：STR-11721-11373-NK92

种属：人

细胞数量：》1*10e7/15ml离心管

传代次数：Px+3

生长方式： 悬浮生长

运输条件：常温运输

细胞特征编码：STR-11721-11373-NK92-TranSM（补液）=72h-DT=24h-IL-2=20ng/ml（200 U/mL）-suspen

细胞特征代码描述：
a、TryEDTA为细胞消化条件和时间，TransMed为细胞换液或补液周期（*1.5T为下次换液的总体积为上次的1.5倍）；
b、DT或G为细胞倍增周期；
c、Puro为稳定株筛选时嘌呤霉素抗性有效浓度。；

d、H-DMEM为高糖DMEM培养基（含糖25mM或4.5g/L）；

f、suspen为悬浮细胞。

细胞抗原表达：CD2 +, CD7 +, CD11a +, CD28 + , CD45 +, CD54 +, CD56 +, CD1 -, CD3 -, CD4 -, CD5 -, CD8 -, CD10 -, CD14 -, CD16 -, CD19 -, CD20 -, CD23 -, CD34 -, HLA-DR -（已验证CD56+高表达）。

STR Profile：

Amelogenin: X,Y，CSF1PO: 11,12，D13S317: 9,12，D16S539: 11,12，D5S818: 12,13，D7S820: 10,11，THO1: 6,9.3，TPOX: 8，vWA: 18

培养条件：

NK-92细胞改良培养条件（目前培养条件）：X-VIVO-15培养基+200 U/mL IL2+5%CO2+O2+95%湿度+37度；不需要添加FBS（胎牛血清）。X-VIVO-15：购置于Lonza，Cat#04-418Q（替代产品#BE02-053Q,https://bioscience.lonza.com/lonza_bs/CH/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000198357/X-VIVO-15-Serum-free-Hematopoietic-Cell-Medium）；IL-2：购置于北京同立海源，Cat#TL-509。

NK-92细胞ATCC首选培养条件：Alpha Minimum Essential medium with 2 mM L-glutamine ，1.5 g/L sodium bicarbonate，0.2 mM inositol (肌醇)，0.1 mM 2-mercaptoethanol (β-巯基乙醇 )，0.02 mM folic acid (叶酸)，100-200 U/ml recombinant IL-2，12.5% horse serum and 12.5% fetal bovine serum（马血清的货号：26050088，Gibco）。

细胞传代条件和方式：

A、NK-92细胞改良传代条件：当细胞成较多“葡萄串”状，透过灯光明显可见大量细胞“颗粒”，表明此细胞生长状态良好。培养基颜色发生变化时或2-3天，通过每次添加4-5ml的完全培养基来代替换液，并垂直放置培养瓶(透气瓶）。当T25瓶内培养基总体积超过25ml以上，可考虑直接传代并补加2倍传代细胞悬液总体积的完全培养基继续扩增；或细胞离心后，细胞计数按照1*10e6/T25瓶/6ml培养体系传代。

B、NK-92细胞ATCC首选传代条件：

When replacing media, centrifuge cells and resuspend cell pellet in fresh medium at 2 to 3 X 105
viable cells/mL. These cells tend to grow in aggregates that may lose viability when they are dispersed. Accurate counts and viabilities may not be possible.

Medium Renewal:
Replace with fresh medium every 2 to 3 days (depending on cell density)

Growth Conditions:
Successful growth of this cell line is very dependent upon the quality of IL-2 used in the growth medium. ATCC recommends using the highest quality IL-2 available.

细胞制备操作：此批次细胞，请按照：15ml离心管内细胞悬液使用“Ⅰ、Cyto-RT-LCI-15ml离心管常温运输的细胞制备操作说明”制备细胞。

Ⅰ、Cyto-RT-LCI-15ml离心管常温运输的细胞制备操作说明:

1、收到细胞后，用75%的酒精喷外包装和15ml离心管的外部（消毒）后，并将离心管放置超净工作台通风。

2、准备2个T25培养瓶（透气盖，分别标记A和B）、预热的完全培养基（15ml离心管内备用完全培养基）后，酒精擦拭离心管外周；拆掉封口膜后，再次酒精擦拭管口（请注意酒精使用安全，酒精喷洒手套和冻存管后未挥发完，有可能引起着火！！！）。

3、直接取7ml细胞悬液（不能吹打，细胞成串或团状），超净台内（无菌操作）接种到预先添加有3ml完全培养基的T25透气瓶A内。垂直放置CO2培养箱，培养扩增48h。

4、配置离心机，1000rpm，将剩余的细胞悬液离心5min后，超净台内（无菌操作）倒掉废液，保留细胞沉淀，或将离心管口酒精灯过火）。

5、15ml离心管内加入7ml完全培养基，重悬成单细胞悬液；并按照“1管传2个T25瓶（》2*10e6/T25瓶/7.5ml培养体系）”移液至T25培养瓶，垂直放置培养箱培养。

细胞扩增24h后观察细胞是否有葡萄串状，并拍照记录。

细胞扩增48h后冻存或传代或补液继续扩增。

Ⅱ、透气/密封盖封口膜密封水平运输的细胞制备操作说明：

1、收到细胞后，用75%的酒精擦拭培养瓶的外部进行多次消毒处理。

2、将培养瓶移入超净工作台，风机调整到最大，用酒精再次擦拭瓶颈、瓶盖。

3、使用镊子拆掉封口膜，并更换新酒精棉球擦拭瓶颈、瓶盖，并通风2min后，瓶口过火（消毒）。

4、拧紧透气瓶盖（若密封盖，培养箱内松一圈），瓶颈、瓶体再次酒精喷洒消毒后水平放置CO2培养箱培养（不需要马上更换培养基）。

5、4h后观察细胞状态和培养基颜色的变化，并做换液或传代的准备。

若细胞密度不大（约5*10e6/T25瓶），培养基变黄时，通过每次添加4-5ml的完全培养基来代替换液，并垂直放置培养瓶。直到培养瓶内总培养体积大于13ml以上（细胞密度非常大，约5*10e6以上），再使用下面离心条件换液或传代：
A、将培养瓶内的细胞用1ml移液器移入到事先准备的15ml无菌离心管内；

配置离心机，1000rpm，离心5min后，超净台内倒掉废液（保留细胞沉淀），将离心管口酒精灯过火；

再添加5ml新鲜的完全培养基重悬成单细胞悬液，更换新的培养瓶分瓶传代继续培养细胞。

以上操作步骤，请使用前熟知，并规范操作、安全使用酒精及酒精灯。

若有问题，请对新更换培养瓶外观拍照和细胞形态显微拍照备案，并邮件CytoBio@qq.com。

Ⅲ、细胞冻存条件：

10% DMSO（Sigma#D2650-100ML）+90% FBS（优质胎牛血清，不需要添加培养基或者其他组份）。冻存细胞请遵守“慢冻存、快复苏”的原则。

Ⅳ、售后服务与安全须知：
1、本中心提供的复苏后常温（或者保温）运输的细胞，收到细胞一周内若有出现非人为的或非实验材料或非实验环境等原因和条件导致的细胞污染或者死亡，将仅免费重新邮寄一瓶或一管（10e5-10e6细胞/T25培养瓶）细胞。
2、本中心提供的干冰运输细胞，保证同批冻存的细胞可以正常复苏，并保证细胞到货时包装箱内有干冰，但不能保证用户收到细胞后是否能顺利复苏细胞。若用户自身实验操作、条件、气候等原因导致的细胞不能复苏或者死亡或污染等，不再免费提供细胞。

若需要重新订购细胞，或赔付或惠赠邮寄细胞，用户都需要承担细胞运输费用和干冰包装费用。超出时限或使用未验证的培养体系和净化环境（细胞房），出现细胞死亡或污染等，不再享受免费售后服务。

所有产品质量投诉、知识产权、安全事宜等相关的赔偿仅限于此细胞当次的交易本身价值或当次细胞本身款项，不涉及其他的赔偿。

实验准备、操作过程中，请一定安全规范操作，确保人身和财产安全、实验室仪器设备等的安全正确使用。

本中心细胞优质优量，细胞形态与官方报道的一致，并无细菌、真菌、支原体等污染。文章发表时可注明：“The NK-92 cell line was gifted from the CytoBiotech Co.,Ltd .And，The 16 short tandem repeat (STR)   was   an exact match for the NK-92 cell line(s) in the DSMZ Online STR matching analysis   (8 core loci plus Amelogenin)”。

Ⅴ、附细胞照片、质控和STR鉴定：

细胞照片（10X、20X、40X）：
a、视野一细胞照片（10X、20X、40X）：

b、视野二细胞照片（4X、10X、20X、40X）：

c、视野三细胞照片（活细胞成像20X、40X）：

CD56阳性表达细胞流式鉴定：

C:细胞活力鉴定（20X活细胞成像）：细胞活力大于90%。

绿色斑点（细胞）为Ki-488染色的死亡细胞。未被染色的细胞（不带绿色荧光的细胞）均为活细胞。

STR鉴定：

基因分型